歐洲放線菌探針法熒光PCR檢測試劑盒反應(yīng)流程常規(guī)程序:

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴(kuò)增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應(yīng)時間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。復(fù)性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

4．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*。

5．PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時也會影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時，如果將反應(yīng)成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。

按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會混合在一起。

phospho-Amyloid Precursor Protein (Tyr757)磷酸化APP(Tyr757)淀粉樣肽前體蛋白抗體

ACTR絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATR抗體

ADAM18去整合素樣金屬蛋白酶18抗體

ATF6活化轉(zhuǎn)錄因子6抗體

AP2 beta銜接蛋白β抗體

Gamma-Adaptin銜接蛋白γ/γ-Adaptin抗體

AQP9水通道蛋白-9抗體

Annexin A3膜粘連蛋白A3抗體

Annexin IV膜粘連蛋白 A4抗體

APG8A自噬相關(guān)蛋白8A抗體

phospho-Akt (Thr450)磷酸化蛋白激酶B抗體

phospho-AMPK alpha-1 (Thr198)磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1抗體

phospho-Akt(Thr308)磷酸化蛋白激酶B抗體

APOBEC3G脫氧胞苷脫氨酶蛋白抗體

AKAP13蛋白激酶錨定蛋白13抗體

AP1M2AP-1μ2抗體

Allergin-1肥大細(xì)胞膜抑制性受體Allergin1抗體

ACCN1腦鈉通道蛋白1抗體

ARP2/3 subunit 1B肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合亞單位B1抗體

ABCG2三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2抗體

alpha 1 Fetoprotein甲胎蛋白抗體

ATM毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白抗體

ABCF2ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白2抗體

ABLIM3肌動蛋白結(jié)合蛋白LIM蛋白3抗體